SERS با قابلیت نانو که دارای عکس های حساس کننده است

کپی رایت © 2015 ناشر بین المللی Ivyspring. تولید مثل برای استفاده شخصی ، غیر تجاری مجاز است ، مشروط بر اینکه مقاله به طور کامل ، اصلاح نشده و به درستی استناد شود. برای شرایط و ضوابط به http://ivyspring. com/terms مراجعه کنید.

داده های مرتبط

شکل S 1-S6. THNOV05P0469S1. PDF (367K) GUID: 335DF6A6-1D80-4232-ACD0-CDEC434248ED

خلاصه

برای انتقال آسیب سلولی مؤثر از طریق فتودینامیک درمانی (PDT) ، تحویل دوز مناسب و غلظت نوری و نورپردازی و نظارت بر دوز PDT تحویل داده شده در محل مورد علاقه بسیار حیاتی است. در داخل بدن نظارت بر دستگاه های حساس کننده در بخش عمده ای از انتشار فلورسانس آنها متکی است. تنظیم کننده های حاوی پالادیوم با نشان دادن تبدیل کامل نور به فعالیت PDT با هزینه داشتن فلورسانس غیر قابل کشف ، نتایج بالینی امیدوارکننده ای را نشان داده اند. ما نشان می دهیم که ، از طریق اتصال نانوذرات پلاسمونی با پالادیوم-فوتوسیتیزایزرها ، پراکندگی رامان با سطح سطح (SERS) هم توانایی گزارشگری و هم نظارت را فراهم می کند تا در غیر این صورت مولکول ها را ترک کند. گزارش SERS با استفاده از NANO از دستگاه های نوری ، امکان جدا کردن مکانیسم های درمانی و تصویربرداری را فراهم می کند تا هر دو پدیده به طور مستقل بهینه شوند. از همه مهمتر ، این طراحی استفاده از همان طول موج لیزر را برای تحریک هر دو ویژگی PDT و تصویربرداری امکان پذیر می کند ، و پتانسیل ایجاد دوز متری در زمان واقعی غلظت نوساختار و تحویل دوز PDT را با نظارت SERS باز می کند.

واژه های کلیدی: پورفیرین ها ، SERS ، Theranostics ، نانوذرات ، PDT ، Dosimetry

معرفی

درمان فوتودینامیک (PDT) استفاده از نور را در طول موج مناسب با یک داروی عکاسی (Photosensitizer) برای تولید گونه اکسیژن واکنش پذیر بسیار سمی (ROS) 1 ترکیب می کند. PDT سابقه طولانی در علاقه بالینی در چندین زمینه از جمله عقیم سازی باکتریایی و درمان سرطان 2 داشته است. پیشرفت های اولیه PDT به دلیل طول موج های تحریک کوتاه از 1 ST Photosensentizer از 1 ST ، به درمان ضایعات سطحی محدود شد ، اما توسعه عکس های حساس کننده در طول موج های طولانی تر ، درمان حجم تومور بزرگتر و در اعماق بیشتر 3 را فعال کرده است. زایمان درمانی بسیار موضعی PDT باعث می شود این روش درمانی به ویژه برای تومورهای منشأ در داخل یا در مجاورت اندامهای حساس یا ساختارهای بافتی مرتبط باشد.

یک رژیم PDT معمولی شامل تحویل سیستمیک یا موضعی از نور حساس کننده و پس از آن تحویل موضعی نور به بافت هدف (به عنوان مثال تومور) است. به منظور دستیابی به اثربخشی و ایمنی بهینه در بیماران خاص ، دوز نوری که به هدف تحویل داده می شود ، غلظت نوری حساس کننده در هدف و برخی از اندازه گیری دوز مؤثر PDT باید کنترل شود. با توجه به تنوع زیاد در خصوصیات نوری بافت بین بیماران ، تحویل دقیق نور به محل مورد علاقه یک چالش است. با این حال ، پیشرفت های قابل توجهی در دستگاه ها و الگوریتم ها برای رسیدگی به این چالش 3 ، 4 وجود داشته است. با توجه به اینکه تعداد زیادی از حساس کننده ها فلورسنت هستند ، اندازه گیری انتشار فلورسانس بیشترین استفاده از رویکرد برای نظارت بر تجمع عکس های حساس کننده بوده است. با این حال ، این رویکرد ممکن است با اتو فلورسانس پس زمینه بافت ها و تغییرات در خصوصیات فلورسانس یک دستگاه نوری سازنده به دلیل ریز محیط های مختلف 5 ، 6 به خطر بیفتد ، که هر دو بر صحت و حساسیت نظارت مبتنی بر فلورسانس تأثیر می گذارند.

دستگاه های نوری پالادیوم (PD) پتانسیل بالینی عالی 7 را نشان داده اند. آنها از خانواده پورفیرینوئید (به عنوان مثال پورفیرین ها ، کلرین ها ، باکتریوکلرین ها) مشتق شده اند که در آن هماهنگی یون PD 2+ ساختار الکترونیکی نوساختارگر را تغییر می دهد به گونه ای که آنها می توانند تقریباً 100 ٪ عملکرد کوانتومی اکسیژن تک را داشته باشند 8 - 10. به طور کلی ، عملکرد کوانتومی فلورسانس با عملکرد کوانتومی اکسیژن مجرد متفاوت است. بنابراین ، PD-Photosensitizer در اصل غیر فلورسانس هستند به طوری که جذب و توزیع بیولوژیکی آنها با استفاده از طیف سنجی فلورسانس یا تصویربرداری قابل کنترل نیست. این یک اشکال قابل توجه است زیرا باید بدون دانستن این تعیین کننده اصلی دوز درمانی ، که ممکن است منجر به نتیجه زیر بهینه 6 شود ، به طور مؤثر درمان شود.

به همین ترتیب ، Photosensitizer Photobleaching تا به امروز عملی ترین روش برای تعیین موثر تحویل درمان PDT 11 ، 12 بوده است ، بر اساس این مفهوم که میزان فوتوبالیاک با میزان اکسیژن تک نفره تولید شده مرتبط است (که برای چندین دستگاه نوری بالینی تأیید شده است)و به همین ترتیب به عنوان یک جانشین برای دومی خدمت می کند. با این حال ، باز هم ، این امر در عمل به دستگاه های نوری فلورسنت محدود است. از طرف دیگر ، نظارت بر انتشار فسفورسانس 1168 نانومتر از PD-Photosensitizer یا انتشار لومینسانس 1270 نانومتر اکسیژن تک قطعه 6 پیشنهاد شده است. با این حال ، این تکنیک ها به دلیل چالش های فنی قابل توجه هنوز به عمل بالینی نرسیده اند.

با الهام از پتانسیل بالینی PD-Porphyrinoids و برای پرداختن به چالش های فوق ، ما از استفاده از خواص فوتوفیزیکی منحصر به فرد نانومواد برای دستیابی به نظارت در داخل بدن این دستگاه های حساس کننده فلورسانس غیرفعال با بهره برداری از پراکندگی سطح سنجش رامان (SERS) استفاده کرده ایم.، همانطور که در شکل 1a نشان داده شده است. 1 A. ما قبلاً در مورد استفاده از پورفیرین-لیپیدهای خود مونتاژ (پیرولیپید) بر روی سطح نانوذرات طلا برای توسعه عوامل پایدار و روشن SERS برای تصویربرداری مولکولی داخل بدن 13 گزارش کرده ایم. این نانوذرات را می توان در یک روش آسان سنتز کرد ، زیرا Pyrolipid به عنوان عامل گزارش دهنده SERS ، Photosensitizer و ترکیب تثبیت کننده نانوذرات عمل می کند. در اینجا ، ما توسعه نانوذرات Theranostic PD-pyrolipid (PDPL-NPS) را نشان می دهیم که ، هنگامی که توسط چراغ قرمز (638 نانومتر) هیجان زده می شوند ، همزمان هر دو از نظر فوتودینامیکی فعال هستند و سیگنال SERS روشن را منتشر می کنند. این یک رویکرد جدید احتمالی برای گزارش داخل بدن از دستگاه های حساس کننده فلورسانس غیرفعال است ، که در آن PDT و عملکرد گزارشگر SERS در زمان واقعی از نانوذرات از همان طول موج تحریک از یک سازه عکس حساس استفاده می کنند. به طور گسترده تر ، برای تنظیم کننده های فتوسنتایزر ، در حالی که فلورسانس و PDT به دو مکانیسم رقابتی متکی هستند ، SERS با قابلیت نانو که گزارش می دهند ، از دو مکانیسم فیزیکی متعامد مکمل ، جذب و پراکندگی استفاده می کنند ، و در نتیجه باعث می شود که خروجی متقابل PDT و SERS باشد.

الف) SERS ذاتی گزارش نانوذرات ترنوستیک که وقتی با نور 638 نانومتر هیجان زده می شود ، همزمان PDT و تصویربرداری مولکولی SERS را تولید می کند. ب) فلزی پالادیوم از پیرولپیید پایه ای با استفاده از روش استات. ج) اندازه گیری فلورسانس پیرولپیید باس آزاد ، منگنز-پیرولیپید و پالادیوم-پیرولیپید در متانول. د) سنتز نانوذرات Theranostic PDPL با استفاده از تکنیک های استاندارد لیپوزوم برای تشکیل PD-Porphysomes که متعاقباً بر روی AUNP ها قرار می گیرند. ه) میکروگراف الکترونی انتقال PDPL-NP با استفاده از رنگ آمیزی لیپید اورانیل استات. ج) طیف جذب و انتشار اجزای مختلف PDPL-NPS.

نتایج و بحث

PD-pyrolipid (PDPL) با استفاده از روش فلزکاری آسان با PD (II) (OAC) سنتز شد₂ and free-base pyrolipid (pyropheophorbide- a conjugated to a 1-palmitoyl-2-hydroxy- sn -glycero-3-phosphocholine backbone): Figure Figure1B. 1 B. The metalation reaction and purification methods gave a 23% yield of the final product,>95 ٪ خالص توسط HPLC-MS (مواد تکمیلی: شکل S1). PDPL به دنبال شلی شدن یون PD 2+ به ماکروسیکل پیرولیدپید ، خاصیت خود مونتاژ پیرولیپید را حفظ می کند و برای روشهای سنتز لیپوزوم مانند (یعنی پورفیزوم) موجود 14 ، 15 قابل تحمل است. PDPL-NP ها با استفاده از انرژی اولتراسونیک در محلول حاوی 60 نانومتر نانوذرات طلای کروی و نانوساختارهای PD-pyrolipid مانند لیپوزوم (PD-Porphysome) فرموله شدند: شکل 1. 1 D. لایه لیپید PDPL-NPS از مولکولهای PD پیرولیپید آمفیفیلیک و DSPE-PEG (distearoylphosphatidylethanolamine-poly (اتیلن گلیکول)) تشکیل شده است. استفاده از DSPE-PEG در فرمولاسیون به تقویت پایداری کلوئیدی و سازگاری بیولوژیکی PDPL-NPS کمک می کند و به عنوان یک لنگر برای ترکیب زیست مولکولهای زیستی برای اعطای هدف قرار می دهد. ما قبلاً سنتز NPS Manganese-pyrolipid SERS (MNPL-NPS) را نشان داده ایم زیرا در شرایط آزمایشگاهی تصویربرداری مولکولی 13 (پروفایل های جذب و انتشار در مواد تکمیلی نشان داده شده است: شکل S2). هر دو متالو-پورفیرین (منگنز و PD-pyrolipid) ساختار الکترونیکی مولکولهای پورفیرین را تغییر داده اند به گونه ای که هر دو فلورسانس غیرفعال هستند (شکل (شکل 1C) 1 C). با این حال ، مکانیسم های اساسی متفاوت هستند. درج PD در پیرولیاپید عملکرد کوانتومی ROS بالا را به پورفیرین می دهد ، در حالی که پورفیرین های چلفت منگنز از آرامش سریع غیر تابشی که در آن انرژی نور جذب شده فقط به انرژی حرارتی 16 تبدیل می شود ، طرفدار آرامش غیر تابشی است. در نتیجه ، MN-pyrolipids از نظر فوتودینامیکی غیرفعال بوده و به عنوان یک عامل کنترل مورد استفاده قرار می گیرند تا اطمینان حاصل شود که نتایج با انقراض بالای جذب نانوذرات طلا اشتباه گرفته نمی شوند.

شکل 1C 1 C نشان می دهد که پیرولیدپید با پایه آزاد یک سیگنال فلورسانس قوی را منتشر می کند ، در حالی که PD- و منگنز پیرولیپیدها به صورت فلورسانس خاموش می شوند. این سه نمونه در متانول در 30 نانومتر حل شدند تا تجمع پورفیرین که می تواند اندازه گیری های فلورسانس را گیج کند ، از بین برود. نسبت های مختلف مولی PDPL و DPSE-PEG می تواند برای محصور کردن AuNP ها برای تولید نانوذرات محصور شده لیپید با ثبات کلوئیدی استفاده شود. افزایش PD-pyrolipid منجر به افزایش سیگنال SERS ، حداکثر 75 ٪ محتوای لیپید PD پیرولیپید (ماده مکمل: شکل S3). نمونه هایی با محتوای PD-pyrolipid به طور قابل توجهی بالاتر از نظر کلوئیدی پایدار نبودند و در طول تصفیه تجمع کردند (داده ها نشان داده نشده است). شکل 1F 1 F ویژگی های طیفی (جذب و انتشار SERS) هر یک از اجزای PDPL-NP را نشان می دهد. انتشار SERS از PDPL-NPS ناشی از نانوذرات یکپارچه ، جایی که محصور سازی لیپیدها به جلوگیری از تجمع نانوذرات کمک می کند. میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و پراکندگی نور پویا (DLS) برای نشان دادن یکپارچه بودن نانوذرات ، Vide Infra استفاده شد. طول موج تحریک به عنوان 638 نانومتر انتخاب شد تا امکان استفاده از چند منظوره کاوشگر فراهم شود. این طول موج با وضوح q است_yانقراض باند PD-pyrolipid که در آن از پراکندگی رزونانس تقویت شده با فلز برای تولید کنتراست تصویربرداری SERS قوی استفاده شده است. علاوه بر این ، PD-pyrolipid به شدت 638 نانومتر نور را جذب می کند و گونه های ROS را برای درمان همزمان PDT تولید می کند. TEM از PDPL-NP نشان دهنده محصور سازی لیپیدها از AuNPs با اورانیل استات با استفاده از پروتکل 13 که قبلاً تأسیس شده است (شکل (شکل 1 E و مواد تکمیلی: شکل S4). DLS برای اندازه گیری اندازه هیدرودینامیکی PDPL-NPS استفاده شد. اندازه گیری ها یک جمعیت یکپارچه با میانگین Z 68 نانومتر (شاخص پلی پراکندگی 0. 38) را نشان داد. شاخص پلی پراکندگی نمایانگر پراکندگی نانوذرات طلای هسته (شرکت Ted Pella) برای ترکیب PDPL-NPS است.

PDPL-NP ها در غلظت های مختلف از 100 fm تا 0. 3 نانومتر برای اندازه گیری اثر غلظت نانوذرات بر شدت SERS تهیه شدند. با استفاده از شرایط تصویربرداری فعلی ، حد تشخیص 100 درجه سانتیگراد یافت شد به گونه ای که قله 755 سانتی مت ر-1 SERS در طول پایه قابل تشخیص بود: شکل شکل 2A. 2 A. مهمتر از همه ، شدت SERS با غلظت نانوذرات به صورت خطی افزایش یافته و امکان گزارش آسان غلظت آن را فراهم می کند. تولید اکسیژن مجرد با استفاده از سنسور اکسیژن تک رنگ سبز (SOSG) مورد سنجش قرار گرفت ، جایی که SOSG با سرعت بسیار زیاد با اکسیژن تک در محلول واکنش نشان می دهد تا مولکولهای SOSG-endoproxide فلورسنت (SOSG-EP) تولید شود. شکل 2B 2 B توانایی PDPL-NPS را در تولید گونه های ROS نسبت به NP های محاصره کننده MN-Pyrolipid 16 شناخته شده PDT نشان می دهد. PDPL-NP ها نشان دهنده نوری وابسته به دوز نور از ROS است که نشان دهنده پتانسیل آنها برای PDT است. همانطور که انتظار می رود ، اندازه گیری فلورسانس SOSG برای MNPL-NP های فعال PDT از طریق درمان نور در ابتدا باقی مانده است. این تعامل مخدوش کننده ، مانند تقویت فلورسانس SOSG-EP با سطح AUNP ، واکنش غیر منتظره شیمیایی (یا فتوشیمیایی) با لیپیدها در محلول SOSG یا تخریب حرارتی سرنوشت ساز SOSG به SOSG-EP است.

الف) شدت SERS وابسته به دوز PDPL-NP با محدودیت تشخیص 500 FM. inset بهتر نشان می دهد شدت SERS در غلظت های نانوذرات کم. ب) سنجش محلول نوری PDT ROS نشان دهنده انتشار ROS وابسته به غلظت PDPL-NP نسبت به PDT Quescent MNPL-NPS و کنترل. ج) شدت SERS وابسته به فوتوبال با افزایش فلورسانس SOSG برای دزیمتری PDT ارتباط دارد. مربع های سیاه با محور y چپ که نشان دهنده سنجش فلورسانس SOSG و محافل قرمز است مطابق با محور y راست اندازه گیری شدت SERS است. د) روش آزمایشگاهی MTT با استفاده از سلولهای KB با PDPL-NPS تحت درمان با غلظت نانوذرات 0-250 بعد از ظهر و دوز نور 10 J/cm 2. داده های مربوط به A و C با میزان فلوت لیزر 250 مگاوات در سانتی متر 2 در حالی که B و D با میزان فلوس 50 مگاوات در سانتی متر 2 به دست آمدند.

نشان داده شده است که از بین بردن سیگنال فلورسانس ، می توان برای محاسبه دوز اکسیژن تک به منطقه مورد علاقه 6 ، از دست دادن سیگنال فلورسانس استفاده کرد. در نتیجه ، ما فرض کردیم که توانایی استفاده از همان طول موج برای القاء PDT و اندازه گیری انتشار SERS باعث می شود که استفاده مشابه از شدت SERS وابسته به فوتوبلینگ به عنوان یک متریک دوز PDT کاهش یابد. برای نشان دادن این موضوع ، ما تغییر شدت سیگنال SERS را در دوزهای مختلف نور بررسی کردیم و از روش SOSG در طول درمان به عنوان یک جانشین برای اندازه گیری فعالیت PDT استفاده کردیم. از آنجا که دوز نور از 0 به 50 j/cm 2 افزایش یافته است ، افزایش قابل توجهی در تولید ROS وجود دارد که با کاهش شدت SERS مطابقت دارد: شکل شکل 2. 2 C. نه انتشار SERS از و نه فلورسانس SOSG تولید شده توسط MNPL-NPS فعال PDT که از پایه منحرف شده است (مواد تکمیلی: شکل S5). از آنجا که ، در این آزمایش ، نانوذرات در محلول به حالت تعلیق درآمده و فقط یک منطقه کوچک تابش می شود ، میزان از دست دادن سیگنال SERS از عکسبرداری در شکل 2C 2 C به احتمال زیاد به دلیل انتشار نانوذرات به داخل و خارج از حجم تابش دست کم گرفته شده است. علاوه بر این ، با افزایش میزان روان از 250 تا 1300 مگاوات در سانتی متر 2 ، تغییر در سیگنال SERS می تواند بیشتر تشدید شود (مواد تکمیلی: شکل S6).

آسیب PDT کارآمد نیاز به بومی سازی داخل سلولی از نورپردازی با اندامک هایی مانند میتوکندری 2 دارد. در نتیجه ، درمان PDT در شرایط آزمایشگاهی با PDPL-NPS با هدف گیرنده فولات انجام شد تا اندوسیتوز 18 آنها را تقویت کند. درصد کمی از لیپیدهای DPSE-PEG (1 ٪) با DSPE-PEG-FOLATE در طول سنتز نانوذرات جایگزین شد. پاسخ دوز دارو PDT با استفاده از سلولهای کارسینوم KB (گیرنده فولات مثبت) با نانوذرات به مدت 4 ساعت قبل از شستشو انکوبه شد. بقای سلول با استفاده از روش MTT اندازه گیری شد. در هر دوز MNPL یا PDPL-NPS ، سلولها با دوز نور 10 J/cm 2 در 638 نانومتر تحت درمان قرار گرفتند. از کنترل های بدون نور نیز استفاده شد. بقای سلولی 24 ساعت پس از درمان اندازه گیری شد (شکل (شکل 2 2 D).

برای نشان دادن اینكه PDPL-NP ها از توانایی تصویربرداری همزمان PDT و SERS برخوردار هستند ، از همان مدل سلولی و شرایط جوجه کشی استفاده شد. آسیب سلول PDT با استفاده از لکه فلورسانس زنده ماندن سلول تصویربرداری شد و انتشار SERS به طور همزمان بر روی میکروسکوپ رامان اندازه گیری شد: شکل های شکل 3 و 4. 4برای تصویربرداری SERS ، یک نقشه کامل طیفی رامان با یک طیف سنج رامان موتوری همراه با میکروسکوپ معکوس مجهز به آرایه CCD سیلیکون عمیق با استفاده از 600/1200/1800 1/میلی متر به دست آمد. در شرایط آزمایشگاهی تصاویر با استفاده از یک هدف 20X به دست آمد که در آن یک تصویر میدان روشن (حالت کنتراست تداخل دیفرانسیل) با تصویر رامان ابرقات از مناطق مورد علاقه پوشانده شده است. بنابراین ، تصاویر رامان نشان داده شده در شکل 3A 3 A تصاویر شبه حلقوی منطقه اصلاح شده با پس زمینه SERS در زیر منحنی در 755 سانتی مت ر-1 برای PDPL-NPS و در 753 سانتی مت ر-1 برای MNPL-NPS هستند. شکل شکل 3A 3 نقشه رامان است که قبل و بعد از PDT برای سلولهای تحت درمان با PDPL-NPS و MNPL-NPS گرفته شده است. توجه داشته باشید ، شدت کلی رامان پس از درمان PDT با PDPL-NPS به طور قابل توجهی پایین تر از قبل از درمان است. شکل شکل 3B 3 B طیف های رامان نماینده نمونه تحت درمان با PDPL-NP را نشان می دهد. این آزمایش همچنین نشان می دهد که نور حساس کننده در طول PDT عکسبرداری شده و مفهوم استفاده از نظارت مبتنی بر SERS را برای دزیمتری PDT اثبات می کند. سلولهای تحت درمان با PDPL-NPS تغییر قابل تشخیص در مورفولوژی پس از درمان PDT نشان می دهند ، همانطور که در تصویر میدان روشن مشهود است که بیشتر نشان دهنده آسیب سلولی ناشی از PDT است (شکل (شکل 3 3).

الف) تصویربرداری مولکولی SERS از سلولهای کارسینوم KB گیرنده مثبت فولات با فولات هدفمند PDPL- و MNPL-NPS. شبه روکش نقشه رامان شبه از منحنی منطقه اصلاح شده پس زمینه در 755 سانتی مت ر-1 تغییر رامان برای PDPL-NP و تغییر 753 سانتی مت ر-1 رامان برای MNPL-NP. تصاویر SERS به دست آمده با میزان فلوس لیزر 250 مگاوات در سانتی متر 2. ب) طیف نماینده SERS از PDPL-NPS از پوشش نقشه قبل و بعد از PDT Raman. میله های مقیاس 25 میکرومتر است.